Բակտերիաների տրանսֆորմացիան և սելեկցիան

Պլազմիդային ԴՆԹ-ի տեղափոխումը բակտերիայի մեջ։ Ինչպես են բակտերիաներն ընտրվում։ Սպիտակուցի արտադրություն և մաքրում։

Հիմնական դրույթներ

Բակտերիաները կարող են օտար ԴՆԹ-ն վերցնել տրանսֆորմացիա կոչվող գործընթացում:
Տրանսֆորմացիան ԴՆԹ-ի կլոնավորման հիմնական քայլն է: Այն տեղի է ունենում ռեստրիկցիոն ֆերմենտներով կտրելուց և լիգացիայից հետո և որի ընթացքում նոր առաջացած պլազմիդը տեղափոխվում է բակտերիայի մեջ։
Տրանսֆորմացիայից հետո բակտերիաները ընտրվում են հակաբիոտիկ պարունակող թասիկներում: Պլազմիդ կրող բակտերիաները կայում են հակաբիոտիկների նկատմամբ, և դրանցից յուրաքանչյուրը գաղութ է առաջացնում։
Ճիշտ պլազմիդ պարունակող գաղութները կարող են աճեցվել՝ նույնական բակտերիաների կուլտուրա ստեղծելու համար, որոնք օգտագործվում են պլազմիդ արտադրելու կամ սպիտակուցներ պատրաստելու համար:

Մեծ պատկերը․ ԴՆԹ-ի կլոնավորում

Տրանսֆորմացիան և ընտրությունը ԴՆԹ-ի կլոնավորման հիմնական քայլերն են։ ԴՆԹ-ի կլոնավորումը ԴՆԹ-ի որոշակի հատվածի, օրինակ՝ գենի բազմաթիվ պատճենների պատրաստման գործընթաց է: Պատճենները հաճախ պատրաստվում են բակտերիաների մեջ:

Կլոնավորման ժամանակ հետազոտողները նախ ԴՆԹ-ի մի հատված, օրինակ՝ գենը, ներմուծում են օղակաձև ԴՆԹ-ի՝ պլազմիդի մեջ: Այս փուլում, որը կոչվում է լիգացիա, օգտագործվում են ռեստրիկցիոն ֆերմենտներ և ԴՆԹ լիգազ։

Լիգացիայից հետո հաջորդ քայլը ԴՆԹ-ի փոխադրումն է բակտերիաների մեջ, որը կոչվում է տրանսֆորմացիա։ Այնուհետև, կարող ենք հակաբիոտիկների միջոցով ընտրել և ուսումնասիրել ԴՆԹ-ն, որպեսզի հայտնաբերենք համար մեր կողմից հետազոտվող պլազմիդը պարունակող բակտերիաները։

Բակտերիաների տրանսֆորմացիայի և ընտրության քայլերը

Ահա բակտերիաների տրանսֆորմացիայի և ընտրության ընթացքը․

Հատուկ պատրաստված բակտերիաները խառնվում են ԴՆԹ-ի հետ (օրինակ՝ լիգացիայի միջոցով ստացված)
Բակտերիաները ջերմային ցնցման են ենթարկվում, որի հետևանքով նրանցից որոշները կլանում են պլազմիդը։
Հիմնական պատասխանն այն է, որ ջերմային ցնցման հետևանքով բակտերիաների թաղանթն ավելի թափանցելի է դարձնում ԴՆԹ-ի մոլեկուլների, օրինակ՝ պլազմիդների համար: Պարզվում է, որ ջերմային ցնցումը բակտերիաների թաղանթի վրա ծակոտիներ է առաջացում, որոնց միջով կարող են անցնել ԴՆԹ մոլեկուլները:
Կլոնավորման ժամանակ օգտագործվող պլազմիդները պարունակում են հակաբիոտիկների նկատմամբ կայունության գեն: Այսպիսով՝ բոլոր բակտերիաները տեղադրվում են հակաբիոտիկ պարունող թասիկի մեջ՝ պլազմիդ պարունակող բակտերիաներն ընտրելու համար:

Պլազմիդ չպարունակող բակտերիաները մահանում են: Պլազմիդ պարունակող յուրաքանչյուր բակտերիա առաջացնում է նույնական, պլազմիդ պարունակող բակտերիաների մի խումբ, որը կոչվում է գաղութ:
Ստուգվում են մի քանի գաղութներ՝ պլազմիդ պարունակող գաղութները հայտնաբերելու համար (օր․՝ ՊՇՌ-ի կամ ռեստրիկցիոն ֆերմենտներով կտրելու միջոցով)։
Պլազմիդ պարունակող գաղութն աճեցվում և օգտագործվում է պլազմիդ կամ սպիտակուցներ արտադրելու համար:

Ինչու՞ է պետք ստուգել գաղութները:

Գաղութներ առաջացնող բոլոր բակտերիաներըը պետք է պարունակեն պլազմիդ (որն ապահովում է հակաբիոտիկների նկատմամբ կայունություն): Սակայն, պարտադիր չէ, որ պլազմիդ պարունակող բոլոր գաղութները ունենան միևնույն պլազմիդը:

Ինչպե՞ս է դա տեղի ունենում: Երբ ԴՆԹ-ն կտրում և կպցնում ենք, բացի պլազմիդից, որը մենք մտադիր ենք կառուցել, հաճախ նաև կարող է կողմնակի արտադրանք առաջանալ: Օրինակ՝ երբ մենք փորձում ենք գեն ներդնել պլազմիդում՝ օգտագործելով որոշակի ռեստրիկցիոն ֆերմենտ, որոշ դեպքերում հնարավոր է, որ պլազմիդը փակվի (առանց գենը վերցնելու) և այլ դեպքեր, երբ գենը սխալ ուղղությամբ ներկառուցվի:

Ենթադրենք՝ փորձում ենք գեն ներդնել պլազմիդում, որպեսզի այն էքսպրեսիայի ենթարկվի բակտերիաներում: Որպեսզի դա անենք, մենք պետք է գենը «կպցնենք» պլազմիդի մեջ հենց պրոմոտերի կողքին միևնույն ուղղությամբ․

Ենթադրենք՝ նույն ֆերմենտով կտրում ենք մեր գենը և պլազմիդը և միացնում հատվածները ԴՆԹ լիգազի միջոցով: Որոշ դեպքերում պլազմիդի ԴՆԹ-ն և գենի ԴՆԹ-ն ճիշտ կերպով կմիանան և կստեղծեն մեր ցանկալի պլազմիդը: Այլ դեպքերում, սակայն, պլազմիդը կարող է պարզապես հետ փակվել (առանց գենը վերցնելու), կամ գենը կարող է սխալ ուղղությամբ միանալ: Սխալ ուղղությամբ ներդրված գենը բակտերիաների մեջ չի կարող էքսպրեսիայի ենթարկվել՝ սպիտակուց ստանալու համար:

Լիգացիան ներառում է ԴՆԹ-ի բազմաթիվ հատվածներ (պլազմիդի միլիարդավոր պատճեններ և գենի միլիարդավոր օրինակներ): Այսպիսով՝ յուրաքանչյուր լիգացիայի ընթացքում մենք կստանանք մի շարք «լավ» պլազմիդներ և մի շարք «վատ» պլազմիդներ: Յուրաքանչյուր գաղութ սկսվում է մեկ պլազմիդ պարունակող բակտերիայից, ուստի գաղութում գտնվող բոլոր բակտերիաները պարունակում են նույն պլազմիդը (կա՛մ «լավ», կա՛մ «վատ»):

Տես ռեստրիկցիոն ֆերմենտների և ԴՆԹ լիգազի մասին հոդվածը ավելի կոնկրետ օրինակի համար, թե ինչպես և ինչու կարող են առաջանալ այս տարբեր արտադրանքները։

Ինչո՞ւ է կարևոր, որ գենը պլազմիդում ճիշտ ներդրվի։ Որոշ դեպքերում դա այդպես չի լինում: Սակայն, եթե մենք ուզում ենք բակտերիաների մեջ գենը էքսպրեսիայի ենթարկել՝ սպիտակուց ստեղծելու համար, գենը պետք է պրոմոտեր-ի կամ վերահսկող հաջորդականության նկատմամբ ճիշտ ուղղությամբ ներկառուցվի: Եթե գենը սխալ ուղղությամբ ներկառուցվի, ԴՆԹ-ի սխալ շղթա տրանսկրիպցիայի կենթարկվի և ոչ մի սպիտակուց չի ստեղծվի:

Այս հնարավորությունների պատճառով կարևոր է յուրաքանչյուր գաղութից հավաքել պլազմիդի ԴՆԹ և ստուգել՝ արդյո՞ք այն համապատասխանում է այն պլազմիդին, որը մենք փորձում էինք կառուցել: Ռեստրիկցիոն ֆերմենտներով կտրումը, ՊՇՌ-ն և ԴՆԹ-ի սեքվենավորումը օգտագործվում են բակտերիայի գաղութից վերցված պլազմիդի ԴՆԹ-ն ուսումնասիրելու համար։

Սպիտակուցի արտադրությունը բակտերիաներում

Ենթադրենք, որ հայտնաբերել ենք «լավ» պլազմիդ պարունակող գաղութ: Ի՞նչ կլինի հետո: Ի՞նչ իմաստ ունի այդ ամենը տրանսֆորմացիայի ենթարկելը, ընտրելը և վերլուծելը:

Հնարավորություն 1․ Բակտերիաներ = պլազմիդ արտադրող գործարան

Որոշ դեպքերում բակտերիաները պարզապես օգտագործվում են որպես «պլազմիդ արտադրող գործարաններ»՝ առաջացնելով մեծաքանակ պլազմիդի ԴՆԹ: Պլազմիդի ԴՆԹ-ն կարող է օգտագործվել ԴՆԹ-ի կլոնավորման հետագա փուլերում (օրինակ՝ ավելի բարդ պլազմիդներ ստեղծելու համար) կամ տարբեր տեսակի փորձերի ժամանակ:

Որոշ դեպքերում պլազմիդներն ուղղակիորեն օգտագործվում են գործնական նպատակներով: Օրինակ՝ պլազմիդներն օգտագործվել են թոքերի հյուսվածքին մարդու գենը հասցնելու համար՝ ցիստիկ ֆիբրոզով տառապող հիվանդների գենաբուժության կլինիկական փորձարկումներում

^{1}

Հնարավորություն 2․ Բակտերիաներ = սպիտակուց արտադրող գործարան

Այլ դեպքերում, բակտերիաները կարող են օգտագործվել որպես սպիտակուցային գործարաններ: Եթե պլազմիդը պարունակում է վերահսկող ճիշտ հաջորդականություններ, բակտերիաները կարող են քիմիական ազդանշանի միջոցով խթանվել և էքսպրեսիայի ենթարկել պարունակվող գենը։ Գենի էքսպրեսիան հանգեցնում է տՌՆԹ-ի արտադրությանը, որը վերածվում է սպիտակուցի: Դրանից հետո բակտերիաները կարող են քայքայվել՝ սպիտակուցն արտազատելու համար:

Բակտերիաները պարունակում են բազմաթիվ սպիտակուցներ և մակրոմոլեկուլներ: Դրա պատճառով նոր պատրաստվող սպիտակուցը պետք է մաքրվի (առանձնացվի մյուս սպիտակուցներից և մակրոմոլեկուլներից)՝ նախքան այն օգտագործելը: Կան մի շարք տարբեր մեթոդներ, որոնք օգտագործվում են սպիտակուցների մաքրման համար:

Աֆինային քրոմատոգրաֆիա կոչվող տեխնիկայում լիզիսի ենթարկված բակտերիաներից անջատվող մոլեկուլների խառնուրդը լցվում է խողովակի կամ հատիկներ լցված գլանի մեջ: Այդ հատիկները պատված են հակամարմնով՝ իմունային համակարգի սպիտակուցով, որը կապվում է մեզ հետաքրքրող մոլեկուլի հետ:

Խողովակում եղած ակամարմինը նախատեսված է մեզ հետաքրքրող սպիտակուցը կապելու համար և չի միանում որևէ այլ սպիտակուցի։ Այսպիսով՝ մեզ հետաքրքրող սպիտակուցը պահվում է խողովակում, իսկ մյուս մոլեկուլները խողովակից հոսում են դուրս: Վերջնական փուլում հետաքրքրող սպիտակուցը դուրս է գալիս խողովակից և հավաքվում՝ օգտագործման համար:

Բացահայտի՛ր «Քան» ակադեմիայից դուրս

Ցանկանո՞ւմ ես ավելին իմանալ բակտերիաների տրանսֆորմացիայի մասին։ Դիտիր LabXchange-ի simulation-ը։

Ցանկանո՞ւմ ես ավելին իմանալ տրանսֆորմացիայի ենթարկված բակտերիաների ընտրության մասին։ Դիտիր LabXchange-ի simulation-ը։

LabXchange-ն օնլայն գիտակրթական անվճար հարթակ է՝ ստեղծված Հարվարդի համալսարանի արվեստի և գիտության ֆակուլտետի կողմից, և աջակցվում է Amgen հիմնադրամի կողմից։

Այս հոդվածի արտոնագրի համարն է՝ CC BY-NC-SA 4.0։

Օգտագործված գրականություն

Alton, E. W. F. W., Armstrong, D. K., Ashby, D., Bayfield, K. J., Bilton, Diana, Bloomfield, E. V., ... Wolstenholme-Hogg, P. (2015). Repeated nebulisation of non-viral CFTR gene therapy in patients with cystic fibrosis: A randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2b trial. Lancet Respiratory Medicine, 3(9), 684-691. http://dx.doi.org/10.1016/S2213-2600(15)00245-3.

Հավելյալ հղումներ

Affibody. (n.d.). Insulin capture from human serum. Retrieved from http://affibody.com/upload/Research%20Reagents/Application%20notes/Insulin%20AFF%20application%20note%202007-03-30.pdf.

Amgen Biotech Experience. (2015). Student guide. Retrieved from https://www.amgenbiotechexperience.com/sites/abe.edc.org/files/abe_english_student_all_sequences_05.15.15.pdf.

Bacterial transformation: The heat shock method. (2016). In (2016). In JoVE science education database. Retrieved from http://www.jove.com/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-shock-method.

Gene therapy breakthrough for cystic fibrosis. (2015, July 3). In NHS choices. Retrieved from http://www.nhs.uk/news/2015/07July/Pages/Gene-therapy-breakthrough-for-cystic-fibrosis.aspx.

Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V., and Jackson, R. B. (2011). DNA tools and biotechnology. In Campbell biology (10th ed., pp. 408-435). San Francisco, CA: Pearson.

Wilkin, D. (2016, March 23). Gene cloning - advanced. In CK-12 biology advanced concepts. Retrieved from http://www.ck12.org/book/CK-12-Biology-Advanced-Concepts/section/9.2/.

Ուզո՞ւմ ես միանալ խոսակցությանը։

Մուտք գործել

Դասակարգել ըստ

Առայժմ հրապարակումներ չկան։

Անգլերեն հասկանո՞ւմ ես: Սեղմիր այստեղ և ավելի շատ քննարկումներ կգտնես «Քան» ակադեմիայի անգլերեն կայքում: