Հիմնական նյութ

Դասընթաց․ (10-րդ դասարան. կենսաբանություն) > Բաժին 5

Դաս 3: Կենսատեխնոլոգիա

ԴՆԹ-ի սեքվենավորում

Ինչպես է ԴՆԹ-ի մի հատվածում հայտնաբերվում նուկլեոտիդային հիմքերի (Ա, Թ, Ց, Գ) հաջորդականությունը։

Հիմնական դրույթներ

ԴՆԹ-ի սեքվենավորումը ԴՆԹ-ի որևէ հատվածում նուկլեոտիդային հաջորդականությունը (Ա, Թ, Ց, Գ) որոշելու եղանակ է։
Սենջերի մեթոդով սեքվենավորման ժամանակ, թիրախ ԴՆԹ-ն բազմիցս կրկնօրինակվում է՝ առաջացնելով տարբեր երկարություններ ունեցող կտորներ: «Շղթայի վերջում գտնվող» լյումինեսցենտային նուկլեոտիդները նշում են այդ հատվածների ծայրերը և թույլ են տալիս որոշել հաջորդականությունը:
Հաջորդ սերնդի սեքվենավորումը նոր, մեծամասշտաբ մոտեցմամբ տեխնիկա է, որը մեծացնում է ԴՆԹ-ի սեքվենավորման արագությունը և նվազեցնում է արժեքը։

Ի՞նչ է սեքվենավորումը

Հնարավոր է՝ լսել ես գենոմների սեքվենավորման մասին: Օրինակ՝ մարդու գենոմն ավարտվեց 2003 թ.-ին՝ երկարամյա, միջազգային ջանքերից հետո: Բայց ի՞նչ է նշանակում սեքվենավորել գենոմը, կամ նույնիսկ ԴՆԹ-ի փոքր կտորը։

ԴՆԹ-ի սեքվենավորումը ԴՆԹ-ի որևէ հատվածում նուկլեոտիդային հաջորդականությունը (Ա, Թ, Ց, Գ) որոշելու եղանակ է։ Այսօր ճիշտ սարքավորումների և նյութերի շնորհիվ ԴՆԹ-ի կարճ հատվածի սեքվենավորումը համեմատաբար պարզ է:

Ամբողջ գենոմի (օրգանիզմի ամբողջ ԴՆԹ-ի) սեքվենավորումը մնում է բարդ խնդիր: Դա պահանջում է գենոմի ԴՆԹ-ի բաժանում շատ ավելի փոքր կտորների, այդ կտորների սեքվենավորման և սեքվենսների՝ հաջորդականությունների հավաքում մեկ երկար «կոնսենսուսի» մեջ: Սակայն, վերջին երկու տասնամյակների ընթացքում մշակված նոր մեթոդների շնորհիվ, գենոմի սեքվենավորումն այժմ շատ ավելի արագ և մատչելի է, քան մարդկային գենոմ ծրագրի ժամանակ էր

^{1}

Այս հոդվածում մենք կանդրադառնանք ԴՆԹ-ի սեքվենավորման համար օգտագործվող մեթոդներին: Մենք կկենտրոնանանք մեկ հաստատված մեթոդի՝ Սենջերի եղանակով սեքվենավորման վրա, բայց կքննարկենք նաև նոր («հաջորդ սերնդի») մեթոդներ, որոնք նվազեցրել են ծախսերը և արագացրել լայնածավալ սեքվենավորման արագությունը:

Սենջերի մեթոդով սեքվենավորումը․ Շղթայի ավարտման մեթոդը

ԴՆԹ-ի հատվածները, որոնց երկարությունը հասնում է մոտ

900

-ի, պարբերաբար սեքվենավորվում են՝ օգտագործելով Սենջերի մեթոդը կամ շղթայի ավարտման մեթոդը: Սենջերի եղանակով սեքվենավորումը մշակվել է բրիտանացի կենսաքիմիկոս Ֆրեդ Սենջերի և նրա գործընկերների կողմից 1977 թ․-ին։

Մարդու գենոմի նախագծում Սենջերի մեթոդն օգտագործվել է մարդու ԴՆԹ-ի համեմատաբար փոքր շատ հատվածներ սեքվենավորելու համար: (Այս հատվածները անպայման չէր, որ ունենային

900

հզ կամ ավելի կարճ երկարություն, բայց հետազոտողները կարողացան «քայլել» յուրաքանչյուր հատվածի երկայնքով՝ օգտագործելով Սենջերի մեթոդը): Հատվածները դասավորվել էին ըստ համընկնող հատվածների՝ հավաքելով ԴՆԹ-ի ավելի երկար հաջորդականություններ և, ի վերջո, ամբողջ քրոմոսոմների հաջորդականություններ։

Չնայած այժմ գենոմները սովորաբար սեքվենավորվում են ավելի արագ և ավելի մատչելի այլ մեթոդներով, Սենջերի մեթոդը դեռ լայնորեն օգտագործվում է ԴՆԹ-ի առանձին մասերի, օրինակ՝ ԴՆԹ-ի կլոնավորման ժամանակ օգտագործվող կամ պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի-ի (ՊՇՌ) արդյունքում առաջացած հատվածները սեքվենավորելու համար։

Սենջերի մեթոդով սեքվենավորման բաղադրիչները

Սենջերի մեթոդը ենթադրում է թիրախ ԴՆԹ-ի հատվածի բազմաթիվ օրինակների պատրաստում: Դրա բաղադրիչները նման են օրգանիզմում ԴՆԹ-ի ռեպլիկացիայի կամ պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի (ՊՇՌ) համար անհրաժեշտ բաղադրիչներին, որը ԴՆԹ-ն կրկնապատկում է in vitro։ Այն ներառում է․

ԴՆԹ պոլիմերազ ֆերմենտը
Պրայմեր՝ միաշղթա ԴՆԹ-ի կարճ հատված, որը կապվում է կաղապար ԴՆԹ-ին և գործում է որպես պոլիմերազի «մեկնարկ»:
ԴՆԹ-ի չորս նուկլեոտիդները (դԱԵՖ, դԹԵՖ, դՑԵՖ, դԳԵՖ)
ԴՆԹ-ի հաջորդականությունը, որը պետք է սեքվենավորվի

Սակայն, Սենեջրի մեթոդով սեքվենավորման ռեակցիան պարունակում է նաև եզակի բաղադրիչ.

Դիդեզօքսի կամ շղթան ավարտող չորս նուկլեոտիդ (դդԱԵՖ, դդԹԵՖ, դդՑԵՖ, դդԳԵՖ), որոնցից յուրաքանչյուրը նշված է տարբեր գույնի ներկով

Դիդեզօքսի նուկլեոտիդները նման են սովորական կամ դեզօքսինուկլեոտիդներին, բայց մեկ առանցքային տարբերություն ունեն՝ նրանց կառուցվածքում բացակայում է շաքարային օղակի 3-րդ ածխածնի հիդրօքսի խումբը: Սովորական նուկլեոտիդում 3-րդ ածխածխնի մոտ եղած հիդրպքսիլ խումբը գործում է որպես «թակարդ՝ թույլ տալով գոյություն ունեցող շղթային ավելացնել նոր նուկլեոտիդ:

Երբ շղթային ավելացվում է դիդեզօքսի նուկլեոտիդ, այլևս չկա հիդրօքսիլ խումբ և չեն կարող ավելացվել այլ նուկլեոտիդներ: Շղթան ավարտվում է դիդեզօքսի նուկլեոտիդով, որը նշվում է ներկի որոշակի գույնով՝ կախված այն կրող հիմքից (Ա, Թ, Ց կամ Գ):

Սենջերի մեթոդը

Սեքվենավորվող ԴՆԹ-ի նմուշը պառնվում է պրայմերի, ԴՆԹ պոլիմերազի և ԴՆԹ-ի նուկլեոտիդների (դԱԵՖ, դԹԵՖ, դԳԵՖ և դՑԵՖ) հետ փորձանոթի մեջ: Ավելացվում են նաև ներկանյութերով պիտակավորված չորս շղթան ավարտող դիդեզօքսի նուկլեոտիդները, բայց շատ ավելի փոքր քանակությամբ, քան սովորական նուկլեոտիդները:

Խառնուրդը նախ տաքացվում է ԴՆԹ-ի նմուշ բնափոխելու (շղթաներն առանձնացնելու) համար, այնուհետև սառեցվում է, որպեսզի պրայմերը կարողանա կապվել միաշղթա կաղապարին: Պրայմերի կապվելուց հետո ջերմաստիճանը կրկին բարձրացվում է՝ թույլ տալով ԴՆԹ պոլիմերազին պրայմերից սկսած սինթեզել նոր ԴՆԹ: ԴՆԹ պոլիմերազը շարունակում է շղթայում նուկլեոտիդներ ավելացնել այնքան ժամանակ մինչև նորմալ նուկլեոտիդի փոխարեն հանդիպի դիդեզօքսի նուկլեոտիդ: Այդ պահին այլևս նուկլեոտիդներ չեն կարող ավելացվել, ուստի շղթան կավարտվի դիդեզօքսի նուկլեոտիդով:

Այս գործընթացը կրկնվում է մի շարք շրձափուլերի ընթացքում: Շրջափուլի ավարտից հետո գործնականում երաշխավորված է, որ գոնե մեկ ռեակցիայի մեջ թիրախ ԴՆԹ-ի յուրաքանչյուր դիրքում դիդեզօքսի նուկլեոտիդ է ներառված: Այսինքն՝ փորձանոթը պարունակելու է տարբեր երկարությամբ հատվածներ, որոնք ավարտվում են սկզբնական ԴՆԹ-ի նուկլեոտիդային դիրքերից յուրաքանչյուրում (տե՛ս ստորև նկարը): Հատվածների ծայրերը պիտակավորված կլինեն ներկանյութով, որոնք մատնանշում են տալիս դրանց վերջին նուկլեոտիդը:

Ոչ, ոչ բոլորը: Պատահականության սկզբունքով է դիդեզօքսի նուկլեոտիդը ներառվում որոշակի պոլիմերացման ռեակցիայի մեջ: ԴՆԹ-ի նոր սինթեզված որոշ կտորներ բաղկացած կլինեն միայն նորմալ, առանց պիտակավորված նուկլեոտիդներից և պարզապես կավարտվեն, երբ կաղապարից պոլիմերազը կընկնի, այլ ոչ թե շղթան ավարտող նուկլեոտիդի ավելացման պատճառով: ԴՆԹ-ի այս ոչ պիտակավորված մոլեկուլները չեն խանգարում սեքվենավորման ռեակցիային, քանի որ դրանք «անտեսանելի» են հայտնաբերման փուլում՝ ներկերի պիտակ չունենալու պատճառով:

Ռեակցիան ավարտելուց հետո հատվածներն անցնում են երկար, բարակ խողովակի միջով, որը պարունակում է գելային մատրիցա՝ մազանոթային գելային էլեկտրաֆորեզ կոչվող գործընթացում: Կարճ հատվածներն արագորեն շարժվում են գելի ծակոտիներով, մինչդեռ երկար հատվածներն ավելի դանդաղ են շարժվում: Երբ յուրաքանչյուր կտոր հատում է խողովակի վերջում գտնվող «ավարտի գիծը», այն լուսավորվում է լազերով՝ թույլ տալով հայտնաբերել իրեն միացած ներկանյութը։

Ամենափոքր հատվածը (երբ պրայմերից հետո միայն մեկ նուկլեոտիդ է ավելացել) առաջինն է անցնում ավարտի գիծը, որին հաջորդում է հաջորդ ամենափոքր հատվածը (երբ պրայմերից հետո երկու նուկլեոտիդ է ավելացել) և այլն: Այսպիսով՝ ընդունիչի վրա մեկը մյուսի հետևից գրանցվող ներկանյութի գույներից ԴՆԹ-ի սկզբնական կտորի հաջորդականությունը կարող է կազմվել նուկլեոտիդ առ նուկլեոտիդ։ Սարքի կողմից արձանագրված տվյալները բաղկացած են լյումինեսցենցիայի ինտենսիվության մի շարք գագաթներից, ինչպես ցույց է տրված վերը նշված քրոմատագրամում: ԴՆԹ-ի հաջորդականությունը կարդացվում է քրոմատագրամի գագաթներից:

Կիրառությունները և սահմանափակումները

Սենջերի եղանակով սեքվենավորմամբ կարելի է ստանալ ԴՆԹ-ի համեմատաբար երկար հատվածների բարձրորակ հաջորդականություններ (մինչև

900

հիմնային զույգ). Այն սովորաբար օգտագործվում է ԴՆԹ-ի առանձին կտորներ, օրինակ՝ բակտերիայի պլազմիդներ կամ ՊՇՌ-ով կրկնապատկված ԴՆԹ սեքվենավորելու համար։

Սակայն, Սենջերի եղանակով սեքվենավորումը թանկ է և անարդյունավետ ավելի մեծածավալ նախագծերի համար, ինչպիսիք են ամբողջական գենոմի կամ մետագենոմի (միկրոօրգանիզմների պոպուլյացիայի «հավաքական գենոմը») սեքվենավորելու համար: Նմանատիպ խնդիրների համար սեքվենավորման նոր, լայնածավալ տեխնիկան ավելի արագ և մատչելի է:

Հաջորդ սերնդի սեքվենավորում

ԴՆԹ-ի սեքվենավորման տեխնոլոգիաների ամենավերջին շարքը հավաքականորեն անվանվում է հաջորդ սերնդի սեքվենավորում:

Գոյություն ունեն նոր սերնդի սեքվենավորման տեխնիկայի բազմաթիվ տեսակներ, որոնք օգտագործում են տարբեր տեխնոլոգիաներ: Սակայն, մեծամասնությունն ունի առանձնահատկությունների ընդհանրություն, որը տարբերակում է նրանց Սենջերի մեթոդից։

Զուգահեռ․ միևնույն ժամանակ սեքվենավորման բազմաթիվ ռեակցիաներ են տեղի ունենում
Միկրո մասշտաբ․ միանգամից բազմաթիվ ռեակցիաներ է հնարավոր իրականցնել չիպի վրա
Արագ․ քանի որ ռեակցիաները զուգահեռ են ընթանում, արդյունքը պատրաստ է շատ ավելի արագ
Մատչելի․ գենոմի սեքվենավորումն ավելի էժան է, քան Սենջերի եղանակով սեքվենավորումը
Կարճ երկարություն․ սովորաբար կարդում է $50$ ‍ $-$ ‍ $700$ ‍ նուկլեոտիդային երկարություն

Գաղափարային տեսանկյունից հաջորդ սերնդի սեքվենավորումը կարծես Սենջերի մեթոդով շատ մեծ թվով ռեակցիաների զուգահեռ ընթացքն է: Այս զուգահեռացման և փոքր մասշտաբի շնորհիվ ավելի մեծ քանակությամբ ԴՆԹ-ն շատ ավելի արագ և էժան կարելի է սեքվենավորել հաջորդ սերնդի մեթոդներով, քան Սենջերի մեթոդով: Օրինակ, 2001 թ.-ին մարդու գենոմի սեքվենավորման գինը գրեթե կազմում էր

$ 100

միլիոն

։ 2015 թ․-ին այն

$ 1245

^{2}

էր։

Ինչո՞ւ է կարևոր արագ և էժան սեքվենավորումը: Գենոմները պարբերաբար սեքվենավորելու ունակությունը նոր հնարավորություններ է բացում կենսաբանության հետազոտության և կենսաբժշկական կիրառությունների համար: Օրինակ՝ էժան սեքվենավորումը քայլ է դեպի անհատականացված բժշկություն, այսինքն՝ անհատի կարիքներին հարմարեցված բժշկական բուժում՝ հիմնված նրա գենոմի գենային տարբերակների վրա:

Վերագրումներ և մեջբերումներ

Մշակված հոդվածի աղբյուրը՝ DNA structure and sequencing, ըստ՝ OpenStax College, Biology (CC BY 4.0)-ի։ Անվճար ներբեռնիր հոդվածի բնօրինակը այստեղ՝ http://cnx.org/contents/185cbf87-c72e-48f5-b51e-f14f21b5eabd@10.4։

Մշակված հոդվածի արտոնագրի համարն է՝ CC BY-NC-SA 4.0

Օգտագործված գրականություն

Lewis, T. (2013, April 14). Human genome project marks 10th anniversary. In LiveScience. Retrieved from http://www.livescience.com/28708-human-genome-project-anniversary.html.
National Human Genome Research Institute. (2016, January 15). DNA sequencing costs. In Large-scale genome sequencing and analysis centers (LSAC). Retrieved from https://www.genome.gov/sequencingcosts/.

Հավելյալ հղումներ

Obenrader, S. (2003). The Sanger method. In Sarah Obenrader: Molecular biology. Retrieved from http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/MolStudents/spring2003/Obenrader/sanger_method_page.htm.

Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V., and Jackson, R. B. (2011). Dideoxy chain termination method for sequencing DNA. In Campbell biology (10th ed., p. 410). San Francisco, CA: Pearson.

Thermo Fisher Scientific. (2016). Sanger sequencing method. In Sanger sequencing. Retrieved from https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/sequencing/sanger-sequencing/sanger_sequencing_method.html.

Ուզո՞ւմ ես միանալ խոսակցությանը։

Մուտք գործել

Դասակարգել ըստ

Առայժմ հրապարակումներ չկան։

Անգլերեն հասկանո՞ւմ ես: Սեղմիր այստեղ և ավելի շատ քննարկումներ կգտնես «Քան» ակադեմիայի անգլերեն կայքում: