Հիմնական նյութ

Դասընթաց․ (10-րդ դասարան. կենսաբանություն) > Բաժին 5

Դաս 3: Կենսատեխնոլոգիա

ԴՆԹ-ի կլոնավորումը․ ամփոփում

Սահմանումը, նպատակը և ԴՆԹ-ի կլոնավորման հիմնական քայլերը

Հիմնական դրույթներ

ԴՆԹ-ի կլոնավորումը մոլեկուլային կենսաբանության մեջ օգտագործվող տեխնիկա է, որը հնարավորություն է տալիս ստանալ ԴՆԹ-ի (գենի)՝ նույնական շատ պատճեններ։
Կլոնավորման փորձի ժամանակ հետաքրքրող գենը ներդրվում է օղակաձև ԴՆԹ-ի մի հատվածի մեջ, որը կոչվում է պլազմիդ։
Պլազմիդը ներկայացվում է բակտերիային մի գործընթացի ընթացքում, որը կոչվում է տրանսֆորմացիա, որից հետո պլազմիդ պարունակող բակտերիաներն ընտրվում են հակաբիոտիկների օգնությամբ։
Ճիշտ պլազմիդ պարունակող բակտերիաներն օգտագործվում են ավելի շատ պլազմիդային ԴՆԹ պատրաստելու կամ, որոշ դեպքերում, խթանվում են, որպեսզի ստեղծեն այդ գենը և համապատասխան սպիտակուցները։

Ներածություն

Լսելով «կլոնավորում» բառը՝ միգուցե մտածես ամբողջական օրգանիզմների, օրինակ, Դոլի ոչխարի կլոնավորման մասին: Սակայն, ինչ-որ բան կլոնավորելու համար անհրաժեշտ է ընդամենը պատրաստել դրա գենետիկորեն ճշգրիտ պատճենը: Մոլեկուլային կենսաբանության լաբորատորիայում ամենից հաճախ կլոնավորվում է գենը կամ ԴՆԹ-ի մեկ այլ փոքր կտոր:

Եթե քո ընկերը, որը մոլեկուլային կենսաբան է, ասում է, որ իր «կլոնավորումը» չի գործում, նա հաստատ խոսում է ԴՆԹ-ի կտորներ պատճենելու մասին, այլ ոչ թե հաջորդ Դոլլին ստեղծելու մասին:

ԴՆԹ-ի կլոնավորման ակնարկ

ԴՆԹ-ի կլոնավորումը ԴՆԹ-ի որոշակի կտորի բազմակի, նույնական պատճենների պատրաստման գործընթաց է: ԴՆԹ-ի կլոնավորման տիպային ընթացակարգում գենը կամ հետաքրքրություն ներկայացնող ԴՆԹ-ի այլ հատվածը (միգուցե բժշկության տեսանկյունից կարևորագույն սպիտակուցի գեն) նախ տեղադրվում է օղակաձև ԴՆԹ-ի մեջ, որը կոչվում է պլազմիդ: Տեղադրումը կատարվում է՝ օգտագործելով ֆերմենտներ, որոնք «կտրում և կպցնում են» ԴՆԹ-ն, և դրա արդյունքում արտադրվում է ռեկոմբինանտ ԴՆԹ-ի մոլեկուլ, կամ բազմաթիվ աղբյուրներից ստացված հավաքական ԴՆԹ:

Դրանից հետո, վերամշակված պլազմիդը ներմուծվում է բակտերիաների մեջ: Պլազմիդ կրող բակտերիաներն ընտրվում և աճեցվում են: Բազմանալիս նրանք վերարտադրում են պլազմիդը և փոխանցում այն իրենց սերունդներին՝ պատճենելով իրենց մեջ պարունակվող ԴՆԹ-ն։

Ի՞նչ իմաստ ունի պլազմիդում ԴՆԹ-ի հաջորդականության շատ օրինակներ պատրաստելը: Որոշ դեպքերում մեզ անհրաժեշտ են ԴՆԹ-ի բազմաթիվ պատճեններ՝ փորձեր կատարելու կամ նոր պլազմիդներ ստեղծելու համար: Այլ դեպքերում, ԴՆԹ-ի հատվածը կոդավորում է օգտակար սպիտակուց, և բակտերիաներն օգտագործվում են որպես «գործարաններ»՝ այդ սպիտակուցը պատրաստելու համար: Օրինակ, մարդու ինսուլինի գենը էքսպրեսիայի է ենթարկվում E․ coli բակտերիայում՝ շաքարախտով հիվանդների կողմից օգտագործվող ինսուլին ստանալու համար:

Եթե քո ընտանիքում կամ ընկերների մեջ կա մեկը, որը շաքարային դիաբետ ունի, ապա հավանաբար գիտես, որ ինսուլին հորմոնը կարևոր դեր ունի մարդու առողջության համար: Առողջ մարդու մարմնում ինսուլինն արտադրվում է ենթաստամոքսային գեղձում: Այն արյան միջոցով ճամփորդում է և, միանալով մարմնի բջիջներին, վերջիններիս թույլ է տալիս ընդունել գլյուկոզ շաքար։

1-ին տիպի շաքարային դիաբետով տառապող մարդու մոտ ենթաստամոքսային գեղձի բջիջները, որոնք արտադրում են ինսուլին, վնասվում կամ ոչնչանում են: 1-ին տիպի շաքարային դիաբետով տառապող մարդիկ պետք է մեկ այլ աղբյուրից ինսուլին պարբերաբար ներարկվեն՝ արյան մեջ շաքարի վտանգավոր բարձր մակարդակը կանխելու համար (և թույլ տալ, որ շաքարը որպես վառելիք մտնի մարմնի բջիջներ):

Երկար տարիներ 1-ին տիպի շաքարային դիաբետ ունեցող մարդկանց օգտագործած ամբողջ ինսուլինը ստացվում էր խոզերի և կովերի ենթաստամոքսային գեղձից, որոնք սպանվել էին մսի համար: Մարդու ինսուլինի մոլեկուլը նման է խոզերի և կովերի ինսուլինին, ուստի խոզից կամ կովից ստացված ինսուլինը կարող է փոխարինել մարդու ինսուլինին 1-ին տիպի շաքարային դիաբետ ունեցող մարդկանց օրգանիզմում:

Սակայն, 1980-ականներից սկսած գիտնականները մշակեցին մարդու ինսուլին պատրաստելու նոր մեթոդներ՝ օգտագործելով Escherichia coli (E. Coli) բակտերիաները: Նրանք բակտերիաները վերածեցին ինսուլին արտադրող փոքրիկ գործարանների: Այս ռեկոմբինանտ ինսուլինը կամ այն ինսուլինը, որը ստացվում է բազմաթիվ աղբյուրների (մարդ և բակտերիաներ) ԴՆԹ-ի համատեղմամբ, այժմ բուժման առաջնային ձևն է, որն օգտագործվում է 1-ին տիպի շաքարային դիաբետ ունեցողների համար։

ԴՆԹ-ի կլոնավորման մեթոդները

ԴՆԹ-ի կլոնավորումն օգտագործվում է բազմաթիվ նպատակների համար: Որպես օրինակ եկ տեսնենք, թե ինչպես կարելի է ԴՆԹ-ի կլոնավորումը օգտագործել բակտերիաների մեջ սպիտակուց (օրինակ՝ մարդու ինսուլին) սինթեզելու համար: Հիմնական քայլերն են.

Կտրիր պլազմիդը և «կպցրու» այն գենի մեջ: Այս գործընթացը կախված է ռեստրիկցիոն ֆերմենտներից (որոնք կտրում են ԴՆԹ-ն) և ԴՆԹ լիգազից (որը միացնում է ԴՆԹ-ն):
Տեղադրիր պլազմինը բակտերիաների մեջ: Օգտագործիր հակաբիոտիկներով ընտրություն անելու մեթոդը, որպեսզի հայտնաբերես այն բակտերիաները, որոնք ընդունել են պլազմիդը։
Աճեցրու պլազմիդներ պարունակող շատ բակտերիաներ և օգտագործիր դրանք որպես «գործարաններ»՝ սպիտակուց պատրաստելու համար: Անջատիր սպիտակուցը բակտերիաներից և մաքրիր այն:

Եկ ավելի ուշադիր դիրատկենք յուրաքանչյուր քայլը․

1. ԴՆԹ-ի կտրումը և ամրացումը

Ինչպե՞ս կարող են տարբեր աղբյուրներից ստացված ԴՆԹ-ի կտորները միավորել իրար հետ: Կա մի հայտնի մեթոդ, որտեղ երկու տեսակի ֆերմենտներ են օգտագործվում՝ ռեստրիկցիոն ֆերմենտներ և ԴՆԹ լիգազ։

Ռեստրիկցիոն ֆերմենտը ԴՆԹ-ն կտրող ֆերմենտ է, որը ճանաչում է որոշակի հաջորդականություն և ԴՆԹ-ն կտրում է երկու մասի այդ վայրում կամ դրա հարևանությամբ: Ռեստրիկցիոն շատ ֆերմենտներ առաջացնում են կտրված ծայրեր, որոնք կարճ են և միաշղթա: Եթե երկու մոլեկուլ համընկնող ծայրեր ունեն, դրանք կարող են մնալ: Սակայն, դրանք չեն միավորվի՝ կազմելով ԴՆԹ-ի անընդհատ մոլեկուլ, քանի դեռ նրանց չի կարել ԴՆԹ լիգազը, որը լրացնում է ԴՆԹ-ի շղթայի բացերը:

Կլոնավորման մեջ մեր նպատակը պլազմիդի մեջ մեզ հետաքրքրող գեն (օրինակ՝ մարդու ինսուլինի համար) տեղադրելն է: Օգտագործելով խնամքով ընտրված ռեստրիկցիոն ֆերմենտ՝ մենք կարողանում ենք մարսել․

Պլազմիդը, որը մի հատվածում կտրված է
Հետաքրքրող գենի հատվածը, որը յուրաքանչյուր ծայրի մոտ ունի կտրված տեղ

Այնուհետև, այդ հատվածները համատեղում ենք ԴՆԹ-ի լիգազի հետ, որը կապում է նրանց՝ գեն պարունակող ռեկոմբինանտ պլազմիդ ստեղծելու համար:

2. Բակտերիայի տրանսֆորմացիան և ընտրությունը

Պլազմիդները և այլ ԴՆԹ-ն կարող են ներմուծվել բակտերիաների, օրինակ՝ լաբորատորիաներում օգտագործվող անվնաս E․ coli-ի մեջ, տրանսֆորմացիա կոչվող գործընթացի միջոցով: Տրանսֆորմացիայի ընթացքում հատուկ պատրաստված բակտերիայի բջիջները ցնցման են ենթարկվում (օրինակ՝ բարձր ջերմաստիճան), որը նրանց խթանում է ընդունել օտար ԴՆԹ-ն:

Հրաշալի հարց է: Զարմանալիորեն, կարծես ոչ ոք լիովին համոզված չէ պատասխանի մեջ, չնայած ջերմային ցնցմամբ տրանսֆորմացիան մոլեկուլային կենսաբանության մեջ շատ տարածված տեխնիկա է: Ընդհանուր առմամբ ենթադրվում է, որ ջերմային ցնցումը փոխում է թաղանթի հեղուկությունը և (կամ) առաջացնում է ծակոտիներ (անցքեր)՝ ԴՆԹ-ի մուտքը դեպի բջիջ ավելի հեշտացնելով

^{1}

Պլազմիդը սովորաբար պարունակում է հակաբիոտիկների նկատմամբ կայունության գեն, որը թույլ է տալիս բակտերիաներին գոյատևել որոշակի հակաբիոտիկի առկայության դեպքում: Այսպիսով՝ պլազմիդ ընդունած բակտերիաները կարող են ընտրվել հակաբիոտիկ պարունակող սննդային թասիկներում: Պլազմիդ չպարունակող բակտերիաները կմահանան, մինչդեռ պլազմիդ տեղափոխող բակտերիաները կարող են ապրել և բազմանալ: Յուրաքանչյուր բակտերիա առաջացնում է գաղութ՝ միանման բակտերիաների խումբ, որոնք բոլորը պարունակում են միևնույն պլազմիդը:

Բոլոր գաղութները պարտադիր չէ, որ պարունակեն ճիշտ պլազմիդը: Պատճառն այն է, որ կարման՝ լիգացիայի ժամանակ ԴՆԹ-ի հատվածները միշտ չէ, որ «կպցվում» են այնպես, ինչպես ուզում ենք: Փոխարենը, մենք պետք է ԴՆԹ հավաքենք մի քանի գաղութներից և տեսնենք, թե արդյոք յուրաքանչյուրը պարունակում է ճիշտ պլազմիդ: Պլազմիդները ստուգելու համար սովորաբար օգտագործվում են ռեստրիկցիոն ֆերմենտներով կտրման և ՊՇՌ մեթոդները։

3. Սպիտակուցի արտադրություն

Երբ գտնենք ճիշտ պլազմիդը պարունակող բակտերիաների գաղութ, կարող ենք պլազմիդ կրող բակտերիաների ավելի մեծ կուլտուրա աճեցնել: Դրանից հետո բակտերիաներին տալիս ենք քիմիական ազդանշան, որը նրանց հրահանգում է արտադրել թիրախային սպիտակուցը:

Բակտերիաները ծառայում են որպես մանրանկարչության «գործարաններ», որոնք ստեղծում մեծ քանակությամբ սպիտակուցներ: Օրինակ՝ եթե մեր պլազմիդը պարունակեր մարդու ինսուլինի գենը, բակտերիաները կսկսեին տրանսկրիպցիայի ենթարկել այդ գենը և տՌՆԹ-ի տրանսլյացիայի հետևանքով արտադրել մարդու ինսուլին սպիտակուցի բազմաթիվ մոլեկուլներ:

Մարդիկ և բակտերիաներն ունեն գենետիկ միևնույն ծածկագիրը, ինչը նշանակում է, որ մարդու գենը կարող է տրանսկրիպցիայի և տրանսլյացիայի ենթարկվել բակտերիաների մեջ:

Սակայն, որպեսզի մարդու գենը էքսպրեսիայի ենթարկվի բակտեիաներում, այն պետք է ունենա մեկ կարևոր փոփոխություն: Մասնավորապես, դրա մեջ պետք է պակասեն ինտրոնները: Ինտրոնները հաջորդականություններ են, որոնք հայտնաբերվում են մարդու շատ գեներում և հանվում են կորիզավոր ՌՆԹ-ի տրանսկրիպտից սփլայսինգ կոչվող գործընթացի միջոցով, որից հետո ՌՆԹ-ն արդեն պատրաստ է։ Բակտերիաներն ինտրոններ չեն պարունակում և ՌՆԹ տրանսկրիպտը սփլայսինգի չեն կարող ենթարկել։

Ինչպե՞ս կարելի է մարդու գենի տարբերակ ստանալ՝ հանված ինտրոններով: Մարդու՝ ինտրոններ չպարունակող գենի տարբերակ կարելի է պատրաստել գենը կոդավորող տՌՆԹ-ից՝ օգտագործելով հակադարձ տրանսկրիպտազ ֆերմենտը: Հակադարձ տրանսկրիպտազը սինթեզում է ԴՆԹ-ի շղթա՝ տՌՆԹ-ի շղթան որպես կաղապար օգտագործելով: ԴՆԹ-ի երկշղթա պարույր ստանալու համար լրացուցիչ քայլից հետո ստացվում է գենի՝ առանց ինտրոնի տարբերակ (կոչվում է կԴՆԹ՝ կոմպլեմենտար ԴՆԹ):

Սպիտակուցն արտադրելուց հետո բակտերիայի բջիջները կարող են կարող են այն բջջից դուրս ուղարկել։ Բացի թիրախ սպիտակուցից (օրինակ՝ ինսուլին), բակտերիաներում կան շատ այլ սպիտակուցներ և մակրոմոլեկուլներ: Այդ պատճառով թիրախ սպիտակուցը պետք է մաքրվի, կամ բջիջների մյուս պարունակությունից պետք է անջատվի՝ կենսաքիմիական տեխնիկայի միջոցով: Մաքրված սպիտակուցը կարող է օգտագործվել փորձերի համար, կամ ինսուլինի դեպքում՝ կիրառվել հիվանդներին ներարկելու համար:

Դե ...և՛ այո, և՛ ոչ: Դեղագործական ընկերությունների կողմից պատրաստված ռեկոմբինանտ ինսուլինը, ըստ էության, առաջանում է բակտերիաների մեջ, և էքսպրեսիայի է ենթարկված այնպիսի պլազմիդից, որը կրում է մարդու ինսուլինի փոփոխված գեն: Բակտերիաների պատրաստած ինսուլինը մաքրվում է՝ օգտագործելով գաղութի մաքրում կոչվող եղանակը։

Սակայն, կենսաբանորեն ակտիվ ինսուլին արտադրելը պահանջում է որոշ լրացուցիչ քայլեր: Ինսուլինը պատրաստվում է որպես մեկ պոլիպեպտիդային շղթա: Սակայն, շղթայի միջև երկսուլֆիդային կապեր պետք է առաջանան և շղթայի մի մասը պետք է կտրվի՝ երկու առանձին շղթաներ ստեղծելու համար (որոնք միասին պահվում են միայն դիսուլֆիդային կապերով): Միայն այդ դեպքում է, որ ինսուլինը կենսաբանորեն ակտիվ է, այսինքն՝ ի վիճակի է հիվանդի մարմնում գործել որպես հորմոն:

Ինսուլինի արտադրությունը, որը կարող է օգտագործվել շաքարային դիաբետ ունեցող հիվանդների կողմից, պահանջում է, որ այս լրացուցիչ քայլերը ներառվեն սպիտակուցների մաքրման ընթացքում, որպեսզի ինսուլին սպիտակուցը ստանա իր ճիշտ եռաչափ ձևը:

ԴՆԹ-ի կլոնավորման կիրառումը

Կլոնավորման տեխնիկայի միջոցով ստեղծվածԴՆԹ-ի մոլեկուլները մոլեկուլային կենսաբանության մեջ օգտագործվում են բազմաթիվ նպատակներով: Օրինակների կարճ ցուցակը ներառում է.

Կենսաբանական դեղագործություն։ ԴՆԹ-ի կլոնավորումը կարող է օգտագործվել կենսաբժշկական եղանակով մարդու սպիտակուցներ պատրաստելու համար, ինչպիսին է վերը նշված ինսուլինը: Ռեկոմբինանտ սպիտակուցների այլ օրինակներ են մարդու աճի հորմոնը, որը տրվում է հիվանդներին, ովքեր ի վիճակի չեն սինթեզել այդ հորմոնը, և հյուսվածքների պլազմինոգեն ակտիվացնող սպիտակուցը (հՊԱ), որն օգտագործվում է կաթվածները բուժելու և արյան մակարդումը կանխելու համար: Նմանատիպ ռեկոմբինանտ սպիտակուցները հաճախ պատրաստվում են բակտերիաների մեջ:
Գենաբուժություն։ Որոշ գենետիկ խանգարումների ժամանակ հիվանդների օրգանիզմում բացակայում է որոշակի գենի ակտիվ ձևը: Գենաբուժության նպատակն է գենի նորմալ կրկնօրինակը տրամադրել հիվանդի մարմնի բջիջներին: Օրինակ՝ ԴՆԹ-ի կլոնավորումը օգտագործվել է պլազմիդներ ստեղծելու համար, որոնք պարունակում են գենի նորմալ տարբերակը, որը ակտիվ չէ ցիստիկ ֆիբրոզի ժամանակ: Երբ պլազմիդները հասցվում են ցիստիկ ֆիբրոզով հիվանդների թոքերին, թոքերի գործառույթը վատացումը դանդաղեց $2$ ‍:
Գենի վերլուծություն։ Գիտահետազոտական լաբորատորիաներում կենսաբանները ԴՆԹ-ի կլոնավորումը հաճախ օգտագործում են գեների արհեստական, ռեկոմբինացիոն տարբերակներ ստեղծելու համար, որոնք օգնում են նրանց հասկանալ, թե ինչպես են գործում օրգանիզմի նորմալ գեները:
Օրինակ՝ պտղաճանճի նեյրոններն ուսումնասիրող գիտնականները կարող են ԴՆԹ կլոնավորումն օգտագործել նյարդային բջջի գենի ռեփորթեր կառուցվածք հավաքելու համար: Այս կառուցվածքում գենի կարգավորող շրջանը (պրոմոտերը) կարող է տեղադրվել լյումինեսցենտային սպիտակուցը կոդավորող գենի դիմաց: Ճանճի մեջ տեղափոխվելիս «ռեփորթեր գենը» էքսպրեսիայի կենթարկվի նույն նեյրոններում, ինչ նեյրոնի գենը՝ պատճառ դառնալով, որ այդ նեյրոնները փայլեն (լուսավորվեն) ուլտրամանուշակագույն լույսի ներքո:

Սրանք ընդամենը մի քանի օրինակներ են, թե ինչպես են այսօր ԴՆԹ-ի կլոնավորումը կիրառում կենսաբանության մեջ: ԴՆԹ-ի կլոնավորումը շատ տարածված տեխնիկա է, որն օգտագործվում է մոլեկուլային կենսաբանության բազմատեսակ կիրառություններում։

Բացահայտի՛ր «Քան» ակադեմիայից դուրս

Ցանկանո՞ւմ ես ավելին իմանալ ռեստրիկցիոն ֆերմենտների մասին: Դիտիր LabXchange-ի այս scrollable interactive-ը simulation-ը։

Ցանկանո՞ւմ ես ավելին իմանալ գենի կլոնավորման ժամանակ ԴՆԹ լիգազի մասին։ Դիտիր LabXchange-ի այս scrollable interactive-ը simulation-ը։

Ցանկանո՞ւմ ես ավելին իմանալ բակտերիաների տրանսֆորմացիայի մասին։ Դիտիր LabXchange-ի simulation-ը։

Ցանկանո՞ւմ ես ավելին իմանալ տրանսֆորմացիայի ենթարկված բակտերիաների ընտրության մասին։ Դիտիր LabXchange-ի simulation-ը։

LabXchange-ն օնլայն գիտակրթական անվճար հարթակ է՝ ստեղծված Հարվարդի համալսարանի արվեստի և գիտության ֆակուլտետի կողմից, և աջակցվում է Amgen հիմնադրամի կողմից։

Այս հոդվածի արտոնագրի համարն է՝ CC BY-NC-SA 4.0։

Օգտագործված գրականություն

Superbest. (2014, June 11). How does heat shock transformation work? In Biology stack exchange. Retrieved from http://biology.stackexchange.com/questions/19038/how-does-heat-shock-transformation-work.
Alton, E. W. F. W., Armstrong, D. K., Ashby, D., Bayfield, K. J., Bilton, Diana, Bloomfield, E. V., ... Wolstenholme-Hogg, P. (2015). Repeated nebulisation of non-viral CFTR gene therapy in patients with cystic fibrosis: A randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2b trial. Lancet Respiratory Medicine, 3(9), 684-691. http://dx.doi.org/10.1016/S2213-2600(15)00245-3.

Հավելյալ հղումներ

Affibody. (n.d.). Insulin capture from human serum. Retrieved from http://affibody.com/upload/Research%20Reagents/Application%20notes/Insulin%20AFF%20application%20note%202007-03-30.pdf.

Amgen Biotech Experience. (2015). Student guide. Retrieved from https://www.amgenbiotechexperience.com/sites/abe.edc.org/files/abe_english_student_all_sequences_05.15.15.pdf.

Biotechnology. (2016, March 23). Retrieved March 29, 2016 from Wikipedia: https://en.wikipedia.org/wiki/Biotechnology.

Gebel, E. (2013). Making insulin: A behind-the-scenes look at producing a lifesaving medication. In Diabetes forecast. Retrieved from http://www.diabetesforecast.org/2013/jul/making-insulin.html?referrer=https://www.google.com/.

Gene therapy breakthrough for cystic fibrosis. (2015, July 3). In NHS choices. Retrieved from http://www.nhs.uk/news/2015/07July/Pages/Gene-therapy-breakthrough-for-cystic-fibrosis.aspx.

R&D Systems. (2016). Recombinant human growth hormone (GH) protein. In Growth hormone. Retrieved from https://www.rndsystems.com/products/recombinant-human-growth-hormone-gh-protein_1067-gh.

Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V., and Jackson, R. B. (2011). DNA tools and biotechnology. In Campbell biology (10th ed., pp. 408-435). San Francisco, CA: Pearson.

Wilkin, D. (2016, March 23). Gene cloning - advanced. In CK-12 biology advanced concepts. Retrieved from http://www.ck12.org/book/CK-12-Biology-Advanced-Concepts/section/9.2/.

Ուզո՞ւմ ես միանալ խոսակցությանը։

Մուտք գործել

Դասակարգել ըստ

Առայժմ հրապարակումներ չկան։

Անգլերեն հասկանո՞ւմ ես: Սեղմիր այստեղ և ավելի շատ քննարկումներ կգտնես «Քան» ակադեմիայի անգլերեն կայքում: