If you're seeing this message, it means we're having trouble loading external resources on our website.

Եթե գտնվում ես վեբ զտիչի հետևում, խնդրում ենք համոզվել, որ *.kastatic.org և *.kasandbox.org տիրույթները հանված են արգելափակումից։

Հիմնական նյութ

Պոլիմերազային շղթայական ռեակցիա (ՊՇՌ)

Տեխնիկա, որն օգտագործվում է ԴՆԹ-ի հատուկ թիրախային հատվածը շատացնելու կամ բազմաթիվ կրկնօրինակներ ստեղծելու համար։

Հիմնական դրույթներ

  • Պոլիմերազային շղթայական ռեակցիան կամ ՊՇՌ-ն ԴՆԹ-ի որոշակի հատվածի բազմաթիվ պատճեններ պատրաստելու in vitro տեխնիկա է (փորձանոթի մեջ, ոչ թե օրգանիզմում):
  • ՊՇՌ-ի հիմքում ընկած է ջերմակայուն ԴՆԹ պոլիմերազը՝ Taq պոլիմերազը և անհրաժեշտ են ԴՆԹ-ի պրայմերներ, որոնք հատուկ մշակված են ԴՆԹ-ի՝ հետաքրքրող հատվածի համար։
  • ՊՇՌ-ի ընթացում ռեակցիան բազմիցս կրկնվում է ջերմաստիճանի մի շարք փոփոխությունների միջոցով, որոնք թույլ են տալիս ստեղծել մեզ հետաքրքրող հատվածի շատ օրինակներ:
  • ՊՇՌ-ն բազմաթիվ հետազոտական և գործնական կիրառություններ ունի: Այն պարբերաբար օգտագործվում է ԴՆԹ-ի կլոնավորման, բժշկական ախտորոշման և ԴՆԹ-ի դատաբժշկական վերլուծության ժամանակ:

Ի՞նչ է ՊՇՌ-ն

Պոլիմերազային շղթայական ռեակցիան (ՊՇՌ) սովորական լաբորատոր տեխնիկա է, որն օգտագործվում է ԴՆԹ-ի որոշակի հատվածի բազմաթիվ օրինակներ (միլիոնավոր կամ միլիարդավոր քանակի) ստեղծելու համար: ԴՆԹ-ի հատվածը կարող է լինել ցանկացած հատված, որը հետաքրքրում է հետազոտողին։ Օրինակ՝ դա կարող է լինել գեն, որի գործառույթը հետազոտողն ուզում է հասկանալ, կամ դատական բժիշկների կողմից օգտագործված գենետիկ ցուցանիշ՝ հանցագործության վայրից վերցված ԴՆԹ-ն կասկածյալների ԴՆԹ-ի հետ համադրելու համար:
Սովորաբար, ՊՇՌ-ի նպատակն է բավարար չափով ԴՆԹ-ի՝ հետաքրքրող հատվածը պատրաստել , որպեսզի այն կարողանա վերլուծվել կամ օգտագործվել այլ կերպ: Օրինակ, ՊՇՌ-ով շատացված ԴՆԹ-ն կարող է ուղարկվել սեքվենավորման, visualized by gel electrophoresis, կամ պլազմիդի մեջ կլոնավորման՝ հետագա փորձեր իրականացնելու համար։
ՊՇՌ-ն օգտագործվում է կենսաբանության և բժշկության շատ ոլորտներում՝ ներառյալ հետազոտությունները մոլեկուլային կենսաբանության մեջ, բժշկական ախտորոշումը և նույնիսկ էկոլոգիայի որոշ ճյուղեր:

Taq պոլիմերազ

ԴՆԹ-ի ռեպլիկացիայի նման ՊՇՌ-ի համար անհրաժեշտ է ԴՆԹ պոլիմերազ ֆերմենտը, որը ստեղծում է ԴՆԹ-ի նոր շղթաներ՝ որպես կաղապար օգտագործելով առկա շղթաները: ՊՇՌ-ի ժամանակ սովորաբար օգտագործվող ԴՆԹ պոլիմերազը կոչվում է Taq պոլիմերազ, որն իր անունը ստացել է ջերմակայոմի բակտերիայից, որից անջատվել է (Thermus aquaticus
T. aquaticus- ն ապրում է տաք աղբյուրներում և հիդրոթերմ աղբյուրներում: Այս բակտերիայի ԴՆԹ պոլիմերազը շատ կայուն է ջերմության նկատմամբ և առավել ակտիվ է մոտ 70°C-ում (սա այնպիսի ջերմաստիճան է, որում մարդու կամ E. Coli -իԴՆԹ պոլիմերազը ակտիվ լինել չեն կարող): Այս ջերմակայունությունը Taq պոլիմերազը դարձնում է իդեալական ՊՇՌ-ի համար: Ինչպես կտեսնենք, բարձր ջերմաստիճանը բազմիցս օգտագործվում է ՊՇՌ-ում՝ կաղապար հնդիսացող ԴՆԹ-ն բնափոխելու կամ շղթաներն իրարից բաժանելու համար։

ՊՇՌ-ի պրայմերներ

Այլ ԴՆԹ պոլիմերազների նման, Taq պոլիմերազը կարող է ԴՆԹ պատրաստել միայն այն դեպքում, եթե դրան ավելացվի պրայմեր՝ նուկլեոտիդների կարճ հաջորդականություն, որը ԴՆԹ-ի սինթեզի համար ելակետ է հանդիսանում: ՊՇՌ-ի ռեակցիայի ժամանակ հետազոտողը որոշում է ԴՆԹ-ի այն հատվածը, որը կպատճենավորվի կամ կշատացվի իր ընտրած պրայմերների միջոցով:
ՊՇՌ-ի պրայմերները միաշղթա ԴՆԹ-ի կարճ հատվածներ են, որոնց երկարությունը սովորաբար մոտ 20 նուկլեոտիդ է: ՊՇՌ-ի յուրաքանչյուր ռեակցիայի ժամանակ օգտագործվում է երկու պրայմեր, և դրանք նախագծված են այնպես, որ գտնվեն հետաքրքրող հատվածի կողքին (այն հատվածը, որը պետք է պատճենվի): Այսինքն, ավելացվում են հաջորդականություններ, որոնք կստիպեն նրանց կապվել կաղապար ԴՆԹ-ին կոմպլեմենտար շղթայի հետ, հենց պատճենվող հատվածի ծայրերին: Պրայմերները կապվում են կաղապարի հետ՝ կոմպլեմենտարության սկզբունքով։
ԴՆԹ-ի կաղապար․
5' ԹԱԹՑԱԳԱԹՑՑԱԹԳԳԱԳԹ...ԳԱԳԹԱՑԹԱԳԹՑՑԹԱԹԳԱԳԹ 3' 3' ԱԹԱԳԹՑԹԱԳԳԹԱՑՑԹՑԱ...ՑԹՑԱԹԳԱԹՑԱԳԳԱԹԱՑԹՑԱ 5'
Պրայմեր 1․ 5' ՑԱԳԱԹՑՑԱԹԳԳ 3' Պրայմեր 2․
Երբ պրայմերները կապված են ԴՆԹ-ին, դրանք կարող են երկարել պոլիմերազի միջոցով, և նրանց միջև ընկած հատվածը կպատճենվի:

ՊՇՌ-ի քայլերը

ՊՇՌ-իի ռեակցիաների հիմնական բաղադրիչներն են Taq պոլիմերազը, պրայմերները, կաղապար ԴՆԹ-ն և նուկլեոտիդները (ԴՆԹ-ի կառուցվածքային ենթամիավորները): Բաղադրիչները խառնվում են մեկ փորձանոթի մեջ, ավելացվում են նաև ֆերմենտի համար անհրաժեշտ կոֆակտորները, և փորձանոթը դրվում է տաքացման և սառեցման կրկնվող ցիկլերի մեջ, որոնք թույլ են տալիս սինթեզել ԴՆԹ:
Հիմնական քայլերն են․
  1. Բնափոխումը (96°C)․ Ռեակցիան ուժեղ տաքացրու՝ ԴՆԹ-ի շղթաներն առանձնացնելու կամ բնափոխելու համար: Սա հաջորդ քայլի համար ապահովում է միաշղթա կաղապար։
  2. Սառեցում (55 - 65°C)․ Սառեցրու ռեակցիան այնպես, որ պրայմերները կարողանան կապվել միաշղթա ԴՆԹ-ի կաղապարի՝ իրենց փոխլրացնող հաջորդականությունների հետ։
  3. Երկարում (72°C)․ Բարձրացրու ռեակցիայի ջերմաստիճանը այնպես որ Taq պոլիմերազը երկարացնի պրայմերները՝ սինթեզելով ԴՆԹ-ի նոր շղթաներ։
ՊՇՌ-ի ընթացքում այս շրջափուլը կրկնվում է 25 - 35 անգամ , որը սովորաբար տևում է 2 - 4 ժամ՝ կախված պատճենվող ԴՆԹ-ի հատվածի երկարությունից: Եթե ռեակցիան արդյունավետ է (լավ է աշխատում), հետաքրքրող հատվածի ընդամենը մեկ կամ մի քանի օրինակը կարող է դառնալ միլիարդ։
Դա այն պատճառով է, որ միայն սկզբնական ԴՆԹ-ն չէ, որն ամեն անգամ օգտագործվում է որպես կաղապար: Փոխարենը, մեկ փուլում ստեղծված նոր ԴՆԹ-ն կարող է ծառայել որպես կաղապար՝ ԴՆԹ-ի սինթեզի հաջորդ փուլում: Ռեակցիայի ընթացքում կան պրայմերների և Taq պոլիմերազի շատ մոլեկուլներ, ուստի ԴՆԹ-ի մոլեկուլների քանակը մոտավորապես կարող է կրկնապատկվել շրջափուլի յուրաքանչյուր շրջանում: Էքսպոնենցիալ աճի այս օրինակը ներկայացված է ստորև բերված նկարում:

Գելային էլեկտրաֆորեզի օգտագործումը ՊՇՌ-ի արդյունքները տեսանելի դարձնելու համար

ՊՇՌ-ի արդյունքները սովորաբար տեսանելի են դարձվում գելային էլեկտրաֆորեզի միջոցով։ Գելային էլեկտրաֆորեզը մի մեթոդ է, որի ընթացքում ԴՆԹ-ի հատվածները էլեկտրական հոսանքի ազդեցությամբ շարժվում են գելով՝ տեղաբաշխվելով ըստ իրենց չափերի: Որպես կանոն, ներառվում է նաև է ստանդարտ նմուշ կամ նմուշ, որը պարունակում է հայտնի չափեր ունեցող ԴՆԹ-ի հատվածներ, որպեսզի ՊՇՌ-ի նմուշի հատվածների չափը հնարավոր լինի որոշել։
Նույն երկարությունն ունեցող ԴՆԹ-ի հատվածները գելի վրա կազմում են «գիծ», որը կարելի է տեսնել աչքով, եթե գելը ներկված է ԴՆԹ-ն կապող ներկով: Օրինակ՝ 400 հիմնային զույգից կազմված ԴՆԹ-ի հատվածը գելի վրա այսպիսի տեսք ունի․
Ձախ կողմում․ ԴՆԹ-ի՝ հայտնի չափեր պարունակող նմուշ․ 100, 200, 300, 400, 500 հիմնային զույգ։
Աջ կողմում․ ՊՇՌ ռեակցիայի արդյունքը, որն ունի 400 հիմնային զույգ։
ԴՆԹ-ի գիծը պարունակում է ԴՆԹ-ի հետաքրքրող հատվածի բազմաթիվ օրինակներ: Քանի որ ԴՆԹ-ն մանրադիտակային է, դրա շատ պատճեններ պետք է լինեն, որպեսզի աչքով հնարավոր լինի այն տեսնել: Սա ՊՇՌ-ի կարևորության մեծ մասն է, քանի որ ՊՇՌ-ի ժամանակ արտադրվում է ԴՆԹ-ի հաջորդականության բավարար օրինակներ, որը հնարավոր է տեսնել։

ՊՇՌ-ի կիրառությունները

ՊՇՌ-ի միջոցով ԴՆԹ-ի հաջորդականությունը կարող է բազմապատկվել միլիոնավոր կամ միլիարդավոր անգամներ՝ ստեղծելով ԴՆԹ-ի բավարար օրինակներ՝ այլ մեթոդներով վերլուծելու համար: Օրինակ՝ ԴՆԹ-ն հնարավոր է տեսանելի դարձնել գելային էլեկտրաֆորեզով, հետո սեքվենավորել կամ կտրել ռեստրիկցիոն ֆերմենտներով և կլոնավորել պլազմիդի մեջ։
ՊՇՌ-ն օգտագործվում է բազմաթիվ հետազոտական լաբորատորիաներում, և այն գործնական կիրառություն ունի նաև դատաբժշկական, գենետիկ թեստավորման և ախտորոշման մեջ: Օրինակ՝ ՊՇՌ-ն օգտագործվում է հիվանդների ԴՆԹ-ից գենետիկ խանգարումների հետ կապված գեները (կամ պտղի ԴՆԹ-ից՝ հղիության ընթացքում փորձարկման դեպքում) շատացնելու համար: ՊՇՌ-ն կարող է օգտագործվել նաև հիվանդի մարմնում բակտերիայի կամ ԴՆԹ վիրուսի հայտնաբերման համար. եթե հարուցիչ կա, հնարավոր է արյան կամ հյուսվածքի նմուշում եղած հարուցչի ԴՆԹ-ն շատացնել։

Խնդրի օրինակ. ՊՇՌ-ն դատաբժշկական փորձաքննություններում

Ենթադրենք՝ աշխատում ես դատաբժշկական լաբորատորիայում և ստացել ես հանցագործության վայրում մնացած մազից անջատված և երեք կասկածյալներից վերցված ԴՆԹ-ի նմուշներ: Քո գործն է ուսումնասիրել որոշակի գենետիկ մարկեր և տեսնել, թե արդյոք երեք կասկածյալներից որևէ մեկի ԴՆԹ-ն համընկնում է մազի ԴՆԹ-ի հետ:
Մարկերը հանդիպում է երկու ալելով կամ տարբերակով: Մեկը պարունակում է մեկ կրկնություն (ներքևում գտնվող շագանակագույն մասը), իսկ մյուսը պարունակում է կրկնության երկու օրինակ: ՊՇՌ-ի ընթացքում, որտեղ պրայմերները միանում են կրկնվող հատվածի կողքին, առաջին ալելն արտադրում է 200 հզ ունեցող ԴՆԹ-ի հատվածր, իսկ երկրորդը՝ 300 հզ պարունակող ԴՆԹ-ի հատված:
Մարկերային ալել 1. Կրկնվող հատվածի կողքին գտնվող պրայմերներն արտադրում են 200 հզ պարունակող ԴՆԹ-ի հատված
Մարկերային ալել 2. Կրկնվող հատվածի կողքին գտնվող պրայմերներն արտադրում են 300 հզ պարունակող ԴՆԹ-ի հատված
ՊՇՌ ես իրականացնում ԴՆԹ-ի չորս նմուշների համար և արդյունքները տեսանելի դարձնում գելային էլեկտրաֆորեզով, ինչպես ցույց է տրված ստորև․
Գելի վրա երևում է հինգ գիծ․
Առաջին գիծը․ Հայտնի ԴՆԹ պարունակող նմուշ՝ 100, 200, 300, 400 և 500 հզ ցույց տվող գծերով։
Երկրորդ գիծը․ Հանցագործության վայրից բերված ԴՆԹ, որն ունի 200 հզ։
Երրորդ գիծը․ #1 կասկածյալի ԴՆԹ-ն, որն ունի 300 հզ։
Չորրորդ գիծը․ #2 կասկածյալի ԴՆԹ-ն, որն ունի 300 հզ։
Հինգերորդ գիծը․ #3 կասկածյալի ԴՆԹ-ն, որն ունի 200 հզ։
Ո՞ր կասկածյալի ԴՆԹ-ն է համապատասխանում հանցագործության վայրի ԴՆԹ-ին:
Ընտրիր ճիշտ պատասխանը։

Ավելին ՊՇՌ-ի և դատաբժշկական փորձաքննությունների մասին

Հանցագործության վայրից բերված ԴՆԹ-ի իրական դատաբժշկական փորձարկումների ժամանակ հետազոտություններն իրականացվում են այնպես, ինչպես վերևի օրինակում նկարագրվեց։ Սակայն, մի շարք տարբեր մարկերներ են համեմատվում (ոչ միայն օրինակում բերվածը) հանցագործության վայրից բերված ԴՆԹ-ի և կասկածյալների ԴՆԹ-ի միջև:
Բացի այդ, տիպիկ դատաբժշկական վերլուծության մեջ օգտագործվող մարկերները պարզապես երկու տարբեր ձևերով չեն: Փոխարենը, դրանք շատ պոլիմորֆ են (պոլի = շատ, մորֆ = ձև): Այսինքն՝ դրանք հանդիպում են բազմաթիվ ալելներով, որոնք իրենց երկարությամբ տարբերվում են փոքր միջակայքերով։
Դատաբժշկական փորձաքննության մեջ օգտագործվող ամենատարածված մարկերները, որոնք կոչվում են կարճ տանդեմային կրկնություններ (ԿՏԿ-ներ), բաղկացած են նույն կարճ նուկլեոտիդային հաջորդականության բազմաթիվ կրկնվող օրինակներից (հիմնականում՝ 2-5 նուկլեոտիդից կազմված)։ ԿՏԿ-ի մի ալելը կարող է ունենալ 20 կրկնություն,մյուսը՝ 18, իսկ մյուսը՝ ընդամենը 101։
Ուսումնասիրելով բազմաթիվ մարկերներ, որոնցից յուրաքանչյուրը հանդիպում է բազմաթիվ ալելային ձևերով, դատական բժիշկները կարող են ԴՆԹ-ի նմուշից ստեղծել եզակի գենետիկ «մատնահետք»: 13 մարկերի օգտագործմամբ սովորական ԿՏԿ վերլուծության ժամանակ կեղծ դրականն (երկու մարդ, ովքեր ունեն նույն ԴՆԹ «մատնահետքը») ավելի քիչ է, քան 10 միլիարդ-ից 11։
Չնայած մենք կարող ենք մտածել ԴՆԹ-ի ապացույցների մասին, որոնք օգտագործվում են հանցագործներին դատապարտելու համար, դրանք վճռական դեր են խաղացել կեղծ մեղադրյալների (այդ թվում՝ երկար տարիներ բանտարկված որոշ անձանց) արդարացման հարցում: Դատաբժշկական վերլուծությունը օգտագործվում է նաև հայրությունը հաստատելու և աղետի վայրերից մարդկային մնացորդները հայտնաբերելու համար:

Ուզո՞ւմ ես միանալ խոսակցությանը։

Առայժմ հրապարակումներ չկան։
Անգլերեն հասկանո՞ւմ ես: Սեղմիր այստեղ և ավելի շատ քննարկումներ կգտնես «Քան» ակադեմիայի անգլերեն կայքում: