Ռեստրիկտազներ և ԴՆԹ լիգազ

Ռեստրիկցիոն մարսում։ Կպչուն և բութ ծայրեր։ Լիգացիայի ռեակցիաներ։

Հիմնական դրույթներ

Ռեստրիկցիոն ֆերմենտները ԴՆԹ-ն կտրող ֆերմենտներ են: Յուրաքանչյուր ֆերմենտ ճանաչում է մեկ կամ մի քանի թիրախ հաջորդականություններ և կտրում է ԴՆԹ-ն այդ հաջորդականություններին մոտ կամ հենց այդ հատվածում։
Ռեստրիկցիոն շատ ֆերմենտներ կատարում են կտրվածքներ՝ առաջացնելով միաշղթա ԴՆԹ-ի սուր ծայրեր: Սակայն, որոշներն առաջացնում են բութ ծայրեր։
ԴՆԹ լիգազը ԴՆԹ-ն կարող ֆերմենտ է: Եթե ԴՆԹ-ի երկու կտոր ունեն համապատասխան ծայրեր, լիգազը կարող է կարել դրանք իրար և առաջացնել ԴՆԹ-ի մեկ, անընդհատ մոլեկուլ:
ԴՆԹ-ի կլոնավորման ժամանակ ռեստրիկցիոն ֆերմենտները և ԴՆԹ լիգազը օգտագործվում են պլազմիդների մեջ գեներ և ԴՆԹ-ի այլ կտորներ տեղադրելու համար:

Ինչպե՞ս կարող ես կտրել և կպցնել ԴՆԹ-ն:

ԴՆԹ-ի կլոնավորման ժամանակ գիտնականները պատրաստում են ԴՆԹ-ի հատվածի՝ գենի բազմաթիվ օրինակներ: Շատ դեպքերում կլոնավորումը ենթադրում է գենի տեղադրում օղակաձև ԴՆԹ-ի մի հատվածում, որը կոչվում է պլազմիդ, որը կարող է պատճենվել բակտերիաներում:

Ինչպե՞ս կարելի է տարբեր աղբյուրներից ստացված ԴՆԹ-ի հատվածները (օրինակ՝ մարդու գենը և բակտերային պլազմիդը) միացնել իրար և ստեղծել ԴՆԹ -ի մեկ մոլեկուլ: Հայտնի մեթոդ կա, որը հիմնված է ռեստրիկցիոն ֆերմենտների և ԴՆԹ լիգազի վրա:

Ռեստրիկցիոն ֆերմենտը ԴՆԹ-ն կտրող ֆերմենտ է, որը ճանաչում է ԴՆԹ-ի հատուկ հաջորդականություններ: Ռեստրիկցիոն մի շարք ֆերմենտներ իրենց ճանաչման տեղամասերում կամ դրանց մոտակայքում կատարում են կտրվածքներ՝ առաջացնելով միաշղթա ծայրեր:
Եթե ԴՆԹ-ի երկու մոլեկուլ ունեն համապատասխան ծայրեր, նրանք կարող են միանալ ԴՆԹ լիգազ ֆերմենտի միջոցով: ԴՆԹ լիգազը կարում է մոլեկուլների միջև եղած բացը՝ ստեղծելով ԴՆԹ-ի մեկ ամբողջական հատված:

Ռեստրիկցիոն ֆերմենտները և ԴՆԹ լիգազը հաճախ օգտագործվում են ԴՆԹ-ի կլոնավորման ընթացքում պլազմիդների մեջ գեներ և ԴՆԹ-ի այլ կտորներ տեղադրելու համար:

Ռեստրիկցիոն ֆերմենտներ

Ռեստրիկցիոն ֆերմենտները հայտնաբերվում են բակտերիաներում (և այլ նախակորիզավորներում): Նրանք ճանաչում և միանում են ԴՆԹ-ի հատուկ հաջորդականությունների, որոնք կոչվում են ռեստրիկցիոն սայթեր: Յուրաքանչյուր ռեստրիկցիոն ֆերմենտ ճանաչում է ընդամենը մեկ կամ մի քանի ռեստրիկցիոն սայթ: Երբ գտնի իր թիրախ հաջորդականությունը, ռեստրիկցիոն ֆերմենտը ԴՆԹ-ի մոլեկուլի վրա կտրվածք կանի: Սովորաբար, կտրման վայրը գտնվում է ռեստրիկցիոն սայթում կամ դրան մոտ և տեղի է ունենում կանխատեսելի ձևով:

Ռեստրիկցիոն ֆերմենտի աշխատանքը հասկանալու համար, թե ինչպես է այն ճանաչում և կտրում ԴՆԹ-ի հաջորդականությունը, եկ քննարկենք EcoRI-ն՝ լաբորատորիաներում օգտագործվող սովորական ռեստրիկցիոն ֆերմենտը: EcoRI-ն կտրում է հետևյալ սայթերում․

Երբ EcoRI-ն ճանաչում և կտրում է այս սայթը, այն միշտ դա անում է շատ հատուկ ձևով, որի արդյունքում առաջանում է միաշղթա ծայրեր ունեցող ԴՆԹ․

Եթե ԴՆԹ-ի մյուս կտորը համապատասխան ծայրեր ունի (օրինակ, քանի որ այն կտրվել է նաև EcoRI-ի միջոցով), այդ երկուսը կարող են կոմպլեմենտարության սկզբունքով իրար միանալ։ Այս պատճառով ասում են, որ ֆերմենտները, որոնք առաջացնում են միաշղթա ծայրեր, արտադրում են կպչուն ծայրեր: Կպչուն ծայրերը կարևոր են կլոնավորման ժամանակ, քանի որ դրանք միասին պահում են ԴՆԹ-ի երկու կտոր՝ կապվելով ԴՆԹ լիգազ ֆերմենտով։

Ոչ բոլոր ռեստրիկցիոն ֆերմենտներն են կպչուն ծայրեր առաջացնում: Ոմանք «բութ կտրողներ» են, որոնք կտրում են թիրախ հաջորդականության ուղիղ մեջտեղում և ծայրեր չեն թողնում: SmaI կոչվող ռեստրիկցիոն ֆերմենտը բութ կտրիչի օրինակ է.

Բութ ծայրեր ունեցող կտորները կարող են միմյանց միանալ ԴՆԹ լիգազի միջոցով: Սակայն, բութ ծայրեր ունեցող կտորներն իրար ավելի դժվար են կապվում (կապման ռեակցիան ավելի քիչ արդյունավետ է և հավանական է, որ ձախողվի), քանի որ ԴՆԹ-ի մոլեկուլները համապատասխան դիրքում պահելու համարմիաշղթա հատվածներ չկան:

Ռեստրիկցիոն ֆերմենտներն իրենց անունը ստացել են այն նախակորիզավորներից, որոնցից անջատվել են: Օրինակ, Escherichia coli բակտերիաներից անջատված ֆերմենտները սկսվում են Eco-ով (օրինակ՝ EcoRI):

3,

000

-ից ավել ռեստրիկցիոն ֆերմենտներ ենանջատվել մի շարք օրգանիզմներից: Մի քանի օրինակներ ներկայացված են ստորև բերված աղյուսակում.

Անունը	Աղբյուրը	Ճանաչման սայթը	Կտրելու ձևը
EcoRI	Escherichia coli	$\begin{aligned} 5^{'} - ԳԱԱԹԹՑ - 3^{'} \\ 3^{'} - ՑԹԹԱԱԳ - 3^{'} \end{aligned}$ ‍	$\begin{aligned} 5^{'} - Գ ↓ ԱԱԹԹՑ - 3^{'} \\ 3^{'} - ՑԹԹԱԱ ↑ Գ - 5^{'} \end{aligned}$ ‍
BamHI	Bacillus amyloliquefaciens	$\begin{aligned} 5^{'} - ԳԳԱԹՑՑ - 3^{'} \\ 3^{'} - ՑՑԹԱԳԳ - 3^{'} \end{aligned}$ ‍	$\begin{aligned} 5^{'} - Գ ↓ ԳԱԹՑՑ - 3^{'} \\ 3^{'} - ՑՑԹԱԳ ↑ Գ - 5^{'} \end{aligned}$ ‍
HindIII	Haemophilus influenzae	$\begin{aligned} 5^{'} - ԱԱԳՑԹԹ - 3 \\ 3^{'} - ԹԹՑԳԱԱ - 5^{'} \end{aligned}$ ‍	$\begin{aligned} 5^{'} - Ա ↓ ԱԳՑԹԹ - 3 \\ 3^{'} - ԹԹՑԳԱ ↑ Ա - 5^{'} \end{aligned}$ ‍
SmaI	Serratia marcescens	$\begin{aligned} 5^{'} - ՑՑՑԳԳԳ - 3 \\ 3^{'} - ԳԳԳՑՑՑ - 5^{'} \end{aligned}$ ‍	$\begin{aligned} 5^{'} - ՑՑՑ ↓ ԳԳԳ - 3 \\ 3^{'} - ԳԳԳ ↑ ՑՑՑ - 5^{'} \end{aligned}$ ‍
SacI	Streptomyces achromogenes	$\begin{aligned} 5^{'} - ԳԱԳՑԹՑ - 3 \\ 3^{'} - ՑԹՑԳԱԳ - 5^{'} \end{aligned}$ ‍	$\begin{aligned} 5^{'} - ԳԱԳՑԹ ↓ Ց - 3 \\ 3^{'} - Ց ↑ ԹՑԳԱԳ - 5^{'} \end{aligned}$ ‍

Մշակված աղյուսակի աղբյուրը՝ Common restriction endonucleases, մշակումը՝ ըստ CK-12 Foundation-ի (CC BY-NC-SA 3.0)։

ԴՆԹ լիգազ

Եթե դու սովորել ես ԴՆԹ-ի ռեպլիկացիայի մասին, ապա գուցե արդեն ծանոթ ես ԴՆԹ լիգազին։ ԴՆԹ-ի ռեպլիկացիայի ժամանակ լիգազի խնդիրն է նոր սինթեզված ԴՆԹ-ի կտորները իրար միացնելը և անխափան շղթայի ստեղծումը: Լիգազները, որոնք օգտագործվում են ԴՆԹ կլոնավորման մեջ, հիմնականում նույն բանն են անում: Եթե ԴՆԹ երկու կտոր համապատասխան ծայրեր ունեն, ԴՆԹ լիգազը կարող է նրանց միացնել և առաջացնել անխափան մոլեկուլ:

Ինչպե՞ս է դա անում ԴՆԹ լիգազը: Օգտագործելով ԱԵՖ-ը՝ որպես էներգիայի աղբյուր, լիգազը կատալիզում է այն ռեակցիան, որի ընթացքում ԴՆԹ-ի մի շղթայի 5' ծայրում գտնվող ֆոսֆատային խումբը միանում է 3' ծայրում գտնվող հիդրօքսիլ խմբին: Այս ռեակցիան առաջացնում է շաքարաֆոսֆատային կմախք։

Օրինակ․ Ռեկոմբինանտ պլազմիդի ստացումը

Եկ տեսնենք, թե ինչպես կարելի է ռեստրիկցիոն մարսումը և լիգացիան օգտագործել պլազմիդում գեն ներմուծելու համար: Ենթադրենք, որ ունենք թիրախ գեն, որի կողքին կան EcoRI ճանաչման սայթեր և պլազմիդ, որը պարունակում է մեկ EcoRI սայթ։

Մեր նպատակն է օգտագործել EcoRI ֆերմենտը՝ գենը պլազմիդ ներմուծելու համար: Նախ, մենք առանձին մարսում ենք (կտրում ենք) գենի հատվածը և պլազմիդը EcoRI-ի միջոցով: Արդյունքում առաջացնում են կպչուն ծայրերով հատվածներ․

Այնուհետև, վերցնում ենք գենի հատվածը և գծային (բացված) պլազմիդը և դրանք խառնում ենք ԴՆԹ լիգազի հետ: Երկու հատվածների կպչուն ծայրերը միմյանց միանում են կոմպլեմենտարության սկզբունքով․

Երբ դրանք միանում են լիգազով, հատվածները դառնում են ամբողջական ԴՆԹ-ի մեկ կտոր: Թիրախ գենն այժմ տեղադրվել է պլազմիդում՝ առաջացնելով ռեկոմբինանտ պլազմիդ:

Ռեստրիկցիոն ֆերմենտներով կտրումը և լիգացիան ներառում են ԴՆԹ-ի բազմաթիվ մոլեկուլներ

Վերոնշյալ օրինակում մենք տեսանք EcoRI-ով կտրված գենի և պլազմիդի միացման արդյունքը: Սակայն, այլ արդյունք կարող է ստացվել հենց այս նույն միացման ժամանակ: Օրինակ, կտրված պլազմիդը կարող է հետ փակվել՝ առանց գենը ներառելու: Նույն կերպ, գենը կարող է մտնել պլազմիդ, բայց հետ շրջվել (քանի որ նրա երկու EcoRI կպչուն ծայրերը նույնական են):

Ռեստրիկցիոն ֆերմենտներով կտրումը և լիգացիան, ինչպես նշված օրինակում էր, կատարվում են պլազմիդի և գենի ԴՆԹ-ի բազմաթիվ կրկնօրինակների համար: Փաստորեն, մեկ միգացիայի ժամանակ օգտագործվում են ԴՆԹ-ի միլիարդավոր մոլեկուլներ: Այս մոլեկուլները պատահականորեն տարբեր ձևերով բախվում են միմյանց և ԴՆԹ լիգազին: Այնպես որ, եթե հնարավոր է պատրաստել բազմաթիվ արտադրանքներ, ապա դրանք բոլորը կարտադրվեն ինչ-որ հաճախականությամբ՝ ներառյալ նրանք, որոնք մենք չենք ցանկանում:

Ինչե՞ս կարող ենք խուսափել «վատ» պլազմիդներից։ Երբ մենք վերափոխում ենք բակտերիան՝ նրան ԴՆԹ միացնելով, ամեն մեկը ԴՆԹ-ի տարբեր հատվածներ է ընդունում։ Մենք կարող ենք վերափոխումից հետո ստուգել բակտերիաները և օգտագործել միայն ճիշտ պլազմիդ ունեցողները: Շատ դեպքերում, փոխակերպված բակտերիայից պլազմիդն ուսումնասիրվում է՝ օգտագործելով մեկ այլ ռեստրիկցիոն քայլ՝ ստուգելու համար, թե արդյոք այն պարունակում է ճիշտ հատված ճիշտ տեղում։

Բացահայտի՛ր «Քան» ակադեմիայից դուրս

Ցանկանո՞ւմ ես ավելին իմանալ ռեստրիկցիոն ֆերմենտների մասին: Դիտիր LabXchange-ի այս scrollable interactive-ը simulation-ը։

Ցանկանու՞մ ես ավելին իմանալ ԴՆԹ լիգազի մասին: Ստուգիր LabXchange-ի այս scrollable interactive-ը և այս simulation-ը։

LabXchange-ն օնլայն գիտակրթական անվճար հարթակ է՝ ստեղծված Հարվարդի համալսարանի արվեստի և գիտության ֆակուլտետի կողմից, և աջակցվում է Amgen հիմնադրամի կողմից։

Մեջբերում

Այս հոդվածի աղբյուրն է DNA cloning - Advanced-ը, ըստ՝ CK-12 Foundation-ի (CC BY-NC 3.0)։

Մշակված հոդվածի արտոնագրի համարն է՝ CC BY-NC-SA 4.0

Հղումներ

Bergmann, D. (2011). Biotechnology. [Course handout] In BIO41: 2011 Molecular Biology lectures on DNA, RNA, and biotechnology.

Metzenberg, S. (2002). Lecture 5: Restriction endonucleases. In Recombinant DNA techniques. Retrieved from http://escience.ws/b572/L5/L5.htm.

Reece, J. B., Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V., and Jackson, R. B. (2011). DNA tools and biotechnology. In Campbell biology (10th ed., pp. 408-435). San Francisco, CA: Pearson.

Restriction site. (2015, December 7). Retrieved March 31, 2016 from Wikipedia: https://en.wikipedia.org/wiki/Restriction_site.

Restriction endonucleases. (2016). In New England biolabs. Retrieved from https://www.neb.com/products/restriction-endonucleases/restriction-endonucleases.

Ուզո՞ւմ ես միանալ խոսակցությանը։

Մուտք գործել

Դասակարգել ըստ

Առայժմ հրապարակումներ չկան։

Անգլերեն հասկանո՞ւմ ես: Սեղմիր այստեղ և ավելի շատ քննարկումներ կգտնես «Քան» ակադեմիայի անգլերեն կայքում: